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中文標(biāo)題：STAT3的激活在TLR4信號(hào)介導(dǎo)的黑色素瘤進(jìn)展中是一個(gè)關(guān)鍵事件

發(fā)表期刊：Cell Death and Disease

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：9.2

發(fā)表時(shí)間：2020年

合作單位：香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)學(xué)院

運(yùn)用技術(shù)：慢病毒載體構(gòu)建，慢病毒包裝（由輝駿生物提供技術(shù)支持）

● 研究背景

黑色素瘤起源于神經(jīng)嵴來(lái)源的黑素細(xì)胞，是一種侵襲性癌癥，惡化速度快，致死率高。其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，到目前為止還沒(méi)有完全闡明。盡管目前針對(duì)不能切除的黑色素瘤的靶向治療和免疫治療顯示出令人振奮的臨床效果，但這種疾病仍然是無(wú)法治愈的。了解黑色素瘤進(jìn)展的機(jī)制將大大促進(jìn)對(duì)抗黑色素瘤的新療法的發(fā)展。

Toll樣受體4(TLR4)是一種負(fù)責(zé)清除病原體的信號(hào)分子。它還與包括黑色素瘤在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生有關(guān)。脂多糖(LPS)是一種TLR4配體，它能促進(jìn)TLR4陽(yáng)性黑色素瘤細(xì)胞的增殖和遷移，而對(duì)TLR4陰性黑色素瘤細(xì)胞則無(wú)此作用。然而，TLR4信號(hào)介導(dǎo)的黑色素瘤發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是一種轉(zhuǎn)錄因子，在黑色素瘤中被結(jié)構(gòu)性激活。STAT3的激活/磷酸化導(dǎo)致一組與黑色素瘤生長(zhǎng)、血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫逃避有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。在結(jié)腸癌患者的腫瘤組織中，已發(fā)現(xiàn)TLR4、MyD88和STAT3的表達(dá)呈正相關(guān)，然而有關(guān)是否存在涉及這三個(gè)分子的通路以及其在大腸癌中是否起致病作用尚不清楚。

● 研究結(jié)果

1. 人黑色素瘤標(biāo)本中TLR4表達(dá)與STAT3磷酸化呈正相關(guān)

為了確定TLR4的表達(dá)與STAT3激活/磷酸化的相關(guān)性，研究者利用人類黑色素瘤組織(總共208個(gè)樣本)進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色(圖1A)。使用H評(píng)分系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行半定量評(píng)估，結(jié)果顯示與正常組織相比，黑色素瘤組織中TLR4和磷酸化STAT3(Y705)的蛋白水平顯著升高(圖1B，C)。進(jìn)一步分析表明，208例黑色素瘤組織中TLR4的表達(dá)和STAT3的磷酸化水平呈正相關(guān)(圖1D)。在男性和女性患者樣本中也發(fā)現(xiàn)TLR4表達(dá)和STAT3磷酸化呈正相關(guān)；在不同年齡組中，TLR4表達(dá)與STAT3磷酸化在中年(40-60歲)和老年(>60歲)患者中呈正相關(guān)，而在年輕(<40歲)患者中無(wú)相關(guān)性。<40歲患者與≥40歲患者觀察結(jié)果不同的原因有待進(jìn)一步探討。總之，TLR4和STAT3在人黑色素瘤組織中的高水平表達(dá)和STAT3磷酸化呈正相關(guān)，提示TLR4和STAT3在黑色素瘤發(fā)病機(jī)制中存在聯(lián)系。

圖1

2. TLR4配體通過(guò)MYD88和TRIF在黑素瘤細(xì)胞中激活STAT3

為了確定TLR4信號(hào)是否涉及黑色素瘤細(xì)胞中的STAT3活化，研究者使用TLR4配體刺激黑色素瘤細(xì)胞，并檢測(cè)STAT3的磷酸化和核定位。結(jié)果表明，兩種TLR4配體LPS和MPLA均能增加多種黑色素瘤細(xì)胞系中STAT3的磷酸化水平(圖2A)。一旦STAT3被磷酸化，它就移位到細(xì)胞核中，在那里它起到轉(zhuǎn)錄因子的作用。研究者還發(fā)現(xiàn)，LPS增加了STAT3在A375細(xì)胞中的核定位(圖2B)，進(jìn)一步證實(shí)了TLR4配體刺激對(duì)STAT3的激活。TLR4和TLR2廣泛表達(dá)于黑色素瘤細(xì)胞，為了確定TLR4對(duì)LPS和MPLA誘導(dǎo)的STAT3激活的必要性，研究者用一種特定的siRNA敲除了A375細(xì)胞中的TLR4，結(jié)果顯示，LPS和MPLA顯著增加了轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(NC)siRNA的A375細(xì)胞中STAT3的磷酸化（圖2C，D）。TLR4基因敲除可完全阻斷LPS和MPLA促進(jìn)的STAT3磷酸化。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了LPS和MPLA誘導(dǎo)的STAT3在黑色素瘤中是通過(guò)TLR4激活的。

在配體識(shí)別時(shí)，TLR4信號(hào)通過(guò)MYD88依賴或TRIF依賴的方式。研究者發(fā)現(xiàn)，沉默MYD88或TRIF，就像沉默TLR4一樣，同時(shí)取消了LPS和MPLA增強(qiáng)的STAT3磷酸化(圖2C，D)。敲除實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MYD88和TRIF都參與了TLR4配體介導(dǎo)的STAT3的激活，此外，TLR4基因的敲除降低了黑色素瘤細(xì)胞中STAT3的蛋白水平，但不降低其mRNA水平(圖2C，E)。MyD88或TRIF基因敲除不影響總STAT3蛋白水平(圖2C，E)。這些觀察表明，TLR4信號(hào)使用不同的機(jī)制來(lái)激活STAT3和維持STAT3蛋白的穩(wěn)定性。

圖2

3. TLR4配體促進(jìn)STAT3介導(dǎo)的細(xì)胞事件在黑色素瘤進(jìn)展中的作用

已經(jīng)觀察到TLR4配體增加了STAT3在黑色素瘤細(xì)胞中的核定位(圖2B)。RT-qPCR結(jié)果顯示，LPS或MPLA刺激黑色素瘤細(xì)胞后，BCL2L1和MCL1、參與黑色素瘤轉(zhuǎn)移和血管生成的MMP-2、MMP-9和VEG的mRNA水平均升高(圖3A)。接下來(lái)，研究者在細(xì)胞模型中研究了TLR4配體是否觸發(fā)了上述基因相關(guān)的惡性行為。結(jié)果表明，MPLA和LPS以相似的方式促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖(圖3B)和侵襲(圖3C)。為了檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞中TLR4信號(hào)是否促進(jìn)血管生成，用MPLA和LPS刺激的A375細(xì)胞的條件培養(yǎng)液分別孵育HUVEC，并計(jì)數(shù)形成的管數(shù)。結(jié)果顯示，兩種條件培養(yǎng)液均能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(圖3D)的管狀形成，表明TLR4信號(hào)通路促進(jìn)了體外血管生成。

MPLA已被臨床測(cè)試為治療包括黑色素瘤在內(nèi)的癌癥的免疫治療劑。研究者發(fā)現(xiàn)MPLA能激活黑色素瘤細(xì)胞中的STAT3。為了檢驗(yàn)MPLA是否刺激免疫抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，研究者收集了MPLA處理的A375細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，并進(jìn)行了細(xì)胞因子陣列檢測(cè)。結(jié)果顯示，刺激MPLA后，ICAM121、IL-622、CXCL1222、G-CSF23和PAI-124等免疫抑制細(xì)胞因子均增加(圖3E，F(xiàn))。G-CSF可以被TLR4信號(hào)上調(diào)，并且能夠激活黑色素瘤中的STAT3。ICAM-1、IL-6、CXCL12和PAI1受STAT3轉(zhuǎn)錄調(diào)控。ICAM-1在改變的蛋白中增加最多。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)其進(jìn)行了定量。結(jié)果證實(shí)，MPLA能顯著增加ICAM-1的分泌，LPS也能增加ICAM-1的分泌(圖3G)。這些結(jié)果表明黑色素瘤細(xì)胞中的TLR4信號(hào)增加了免疫抑制細(xì)胞因子的分泌，這種細(xì)胞因子可以被STAT3上調(diào)。

接下來(lái)，研究者研究了TLR4信號(hào)介導(dǎo)的黑色素瘤進(jìn)展中的細(xì)胞事件是否需要STAT3的激活。為此，研究者建立了一對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞株B16STAT3β(高表達(dá)STAT3β的細(xì)胞)和B16NC(含有空載體的陰性對(duì)照細(xì)胞株)。WB結(jié)果顯示，B16STAT3β細(xì)胞中針對(duì)Bclxl、Mcl-1、VEGF和MMP2的STAT3蛋白水平均低于B16NC細(xì)胞(圖3H)，表明STAT3β可阻斷STAT3的激活。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脂多糖和MPLA均能顯著促進(jìn)B16NC細(xì)胞的增殖(圖3I)和侵襲(圖3J)，但對(duì)B16STAT3β細(xì)胞無(wú)明顯影響，提示STAT3的激活在β信號(hào)誘導(dǎo)的黑色素瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。

圖3

4. 組成性TLR4信號(hào)增強(qiáng)STAT3激活促進(jìn)小鼠黑色素瘤進(jìn)展

為了確定體內(nèi)黑色素瘤中TLR4和STAT3之間的關(guān)系，研究者建立了一對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞系A(chǔ)375CA-TLR4（含有TLR4的組成型活性變體）和A375NC（含有空載體的陰性對(duì)照細(xì)胞系），然后比較兩種細(xì)胞系中的STAT3活性，并進(jìn)一步比較了A375CA-TLR4和A375NC荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和EMT。結(jié)果顯示A375CA-TLR4細(xì)胞中磷酸化STAT3的蛋白質(zhì)水平和STAT3的轉(zhuǎn)錄活性高于A375NC細(xì)胞（圖4A，B），表明TLR4的組成型活化增強(qiáng)了黑素瘤細(xì)胞中的STAT3活化。EMT是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的早期事件，在A375CA-TLR4細(xì)胞中觀察到了EMT樣形態(tài)學(xué)特征，例如失去細(xì)胞間相互作用和紡錘形表型（圖4C），表明TLR4活化促進(jìn)黑素瘤中的EMT過(guò)程。

在A375CA-TLR4和A375NC異種移植小鼠模型中，A375CA-TLR4異種移植瘤的重量比A375NC組重(圖4D)。在A375CA-TLR4腫瘤中，總的和磷酸化的STAT3蛋白水平均上調(diào)(圖4E)。腫瘤組織免疫組化染色顯示，A375CA-TLR4腫瘤與A375NC腫瘤相比，Ki-67(細(xì)胞增殖標(biāo)記物)、CD31(血管生成標(biāo)記物)、N-cadherin(兩種間質(zhì)標(biāo)記物)和vientin(波形蛋白)蛋白水平均有升高，E-cadherin(上皮性標(biāo)記物)水平降低(圖4F)。這些數(shù)據(jù)表明，TLR4的激活增強(qiáng)了黑色素瘤組織中STAT3的激活，并促進(jìn)了小鼠腫瘤的生長(zhǎng)、血管生成和EMT。

圖4

5. TLR4信號(hào)介導(dǎo)的小鼠黑色素瘤進(jìn)展需要STAT3的激活

接下來(lái)，研究者在存在或不存在LPS的情況下分別將懸浮在PBS中的B16NC和B16STAT3β細(xì)胞皮下注射到小鼠體內(nèi)。腫瘤稱重顯示，B16STAT3β腫瘤比B16NC腫瘤更小更輕（圖5A）。此外，LPS促進(jìn)B16NC腫瘤中的腫瘤生長(zhǎng)（圖5A）和STAT3活化（圖5B），但對(duì)B16STAT3β腫瘤的影響較小，表明STAT3活化在TLR4信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)的黑素瘤生長(zhǎng)中起積極作用。腫瘤組織的IHC染色顯示，與沒(méi)有LPS刺激的B16NC腫瘤相比，LPS刺激的B16NC腫瘤中Ki-67，CD31，N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)水平增加，而E-鈣粘蛋白的表達(dá)降低（圖5C）。IHC染色結(jié)果揭示了STAT3活化在TLR4信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)的黑素瘤生長(zhǎng)、血管生成和EMT中的重要作用。

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，LPS刺激增加了B16NC荷瘤小鼠脾髓系來(lái)源的抑制細(xì)胞（MDSC；CD11b+Gr-1+細(xì)胞）的百分比，但對(duì)B16STAT3β荷瘤小鼠無(wú)明顯影響（圖5D）。MDSC負(fù)責(zé)免疫抑制，從而限制CD8T細(xì)胞的活性和腫瘤浸潤(rùn)。在LPS刺激下，B16NC荷瘤小鼠脾臟和腫瘤浸潤(rùn)性CD8(CD3+CD8+)T細(xì)胞的百分比顯著降低(圖5D)。在B16STAT3β荷瘤小鼠中，LPS對(duì)脾臟CD8 T細(xì)胞數(shù)量的降低作用弱于B16NC荷瘤小鼠(圖5D)，提示STAT3激活在LPS誘導(dǎo)的脾臟CD8 T細(xì)胞減少中起作用。流式細(xì)胞分析還顯示，LPS刺激的B16NC腫瘤中NK細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，而沒(méi)有LPS刺激的B16NC腫瘤中則沒(méi)有（圖5D）。通過(guò)在腫瘤中表達(dá)STAT3β來(lái)阻斷STAT3的激活，可增加腫瘤浸潤(rùn)的NK細(xì)胞，并減弱LPS誘導(dǎo)的NK細(xì)胞減少(圖5D)。這些變化提示，在黑色素瘤微環(huán)境中，STAT3的激活參與了TLR4信號(hào)介導(dǎo)的免疫抑制。

圖5

6. 藥物抑制TLR4/STAT3通路可抑制黑色素瘤細(xì)胞的體內(nèi)外增殖

接下來(lái)，研究者使用了在多種癌細(xì)胞中抑制TLR4和STAT3通路的天然倍半萜內(nèi)酯——小白菊內(nèi)酯，以及TLR4拮抗劑TAK-242，來(lái)檢測(cè)抑制TLR4/STAT3通路是否會(huì)抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示，小白菊內(nèi)酯和TAK-242均呈劑量依賴性地降低A375和B16黑色素瘤細(xì)胞的TLR4、STAT3和磷酸化STAT3的蛋白水平，并抑制其增殖(圖6B)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小白菊內(nèi)酯呈劑量依賴性地降低腫瘤重量和腫瘤體積，而不影響小鼠的體重。WB結(jié)果顯示，小白菊內(nèi)酯顯著降低B16腫瘤中TLR4、STAT3和磷酸化STAT3的蛋白水平(圖6F)。這些結(jié)果均表明，抑制TLR4/STAT3通路是治療黑色素瘤的可行策略。

圖6