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中文標(biāo)題：FEN1 L209P突變干擾長(zhǎng)斑塊堿基切除修復(fù)并誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

發(fā)表期刊：Oncogene

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：8.756

發(fā)表時(shí)間：2016年6月

合作單位：南京師范大學(xué)

運(yùn)用技術(shù)：載體構(gòu)建（由輝駿生物提供技術(shù)支持）

● 研究背景

基因組DNA不斷暴露于內(nèi)源性或外源性損傷中，從而導(dǎo)致DNA損傷。DNA損傷如果不修復(fù)，可能導(dǎo)致基因突變和隨后的基因組不穩(wěn)定以及癌癥的發(fā)生。 DNA損傷的清除和基因組完整性的維持取決于強(qiáng)大的細(xì)胞DNA修復(fù)系統(tǒng)，而堿基切除修復(fù)是真核細(xì)胞處理內(nèi)源性和外源性DNA堿基損傷的主要修復(fù)途徑之一。LP-BER是修復(fù)細(xì)胞核和線粒體氧化堿基的主要途徑，BER是通過(guò)特異性DNA糖基化酶切除受損堿基，然后通過(guò)AP核酸內(nèi)切酶1（APE1）切割DNA骨架而啟動(dòng)的，這種中間結(jié)構(gòu)可以通過(guò)SP-BER或LPBER途徑加工。FEN1在LP-BER中起著核心作用，對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性和完整性是必不可少的。FEN1是一種結(jié)構(gòu)特異的核酸酶，具有5‘翻蓋內(nèi)切酶(FEN)、5’-3‘外切酶(EXO)和間隙核酸內(nèi)切酶(GEN)活性。在小鼠模型中，缺乏Gen和EXO活性的FEN1突變會(huì)導(dǎo)致肺腺瘤的高發(fā)病率，F(xiàn)EN1的功能缺陷與人類癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加之間也存在聯(lián)系。

盡管在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了許多其他DNA修復(fù)基因的體細(xì)胞突變，但FEN1突變非常罕見(jiàn)，這表明FEN1對(duì)正常的DNA新陳代謝很重要。近來(lái)在人結(jié)腸癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)FEN1中體細(xì)胞的、非同義的、雜合性的單核苷酸替換，它們分別是：E20D、L209P、R245G和S329N。確定這些突變是否會(huì)影響FEN1的功能并促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展，這一點(diǎn)很重要。

● 研究結(jié)果

1. L209P變異在結(jié)腸癌中的發(fā)生

FEN1對(duì)于維持基因組DNA的穩(wěn)定性和完整性很重要，研究者推測(cè)FEN1功能缺失突變可能會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展。癌癥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)癌癥類型的腫瘤組織中都存在雜合的FEN1體細(xì)胞突變，33例結(jié)直腸癌患者的FEN1突變頻率最高(圖1A)。已在結(jié)直腸癌中檢測(cè)到四個(gè)FEN1突變，分別是E20D、L209P、R245G和S329N(圖1B)。研究者重點(diǎn)研究了L209P突變，因?yàn)樗挥诤诵暮怂崦赣?圖1C)，并且在進(jìn)化上是保守的。為了預(yù)測(cè)L209P突變對(duì)FEN1活性和DNA底物結(jié)合的影響，研究者進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，L209P突變會(huì)導(dǎo)致FEN1活性喪失，但并沒(méi)有明顯改變FEN1/DNA的相互作用，這與觀察到的其不影響DNA結(jié)合的結(jié)果一致。為了部分驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，在大腸桿菌中表達(dá)了FEN1 L209P和WT，并將其純化為均一(圖1E)。圓二色譜分析結(jié)果顯示L209P FEN1蛋白在22℃時(shí)與WT FEN1蛋白的構(gòu)象幾乎相同(圖1F)，表明脯氨酸到亮氨酸的轉(zhuǎn)變對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象沒(méi)有明顯影響。為了研究L209P突變是否影響FEN1的熱穩(wěn)定性，研究者還在37°C進(jìn)行了圓二色譜分析(圖1G)。結(jié)果表明，L209P FEN1的整體結(jié)構(gòu)與WT FEN1相似，說(shuō)明FEN1的熱穩(wěn)定性不受L209P突變的影響。

圖1

2. FEN1 L209P突變體缺乏三種核酸酶活性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)和評(píng)估L209P突變對(duì)FEN1生化活性的影響，研究者使用合成的DNA底物在體外檢測(cè)了L209P FEN1的FEN1的FEN、EXO和GEN活性。正如圖1D所預(yù)測(cè)的那樣，當(dāng)在37°C測(cè)定時(shí)，L209P突變幾乎完全消除了FEN1的三種活性(圖2A-C)。由于L209P和WT FEN1在22°C和37°C具有相同的整體結(jié)構(gòu)，因此L209P FEN1活性的缺陷不太可能是由于L209P蛋白對(duì)溫度的敏感性造成的。

圖2

3. L209P FEN1保持完整的DNA底物結(jié)合能力

由于L209P FEN1與WT FEN1具有相同的整體結(jié)構(gòu)(圖1f)，因此全局結(jié)構(gòu)缺陷不太可能是L209P FEN1活性降低的原因。研究者使用凝膠偏移(圖3A、C和E)和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)分析(圖3B、D和F)來(lái)確定FEN1-DNA結(jié)合親和力。兩種檢測(cè)方法均顯示L209P變異體與WT FEN1的DNA結(jié)合親和力無(wú)差異。這一結(jié)果與之前的觀察結(jié)果一致，即只有帶正電荷的氨基酸，如第70、245和327位的精氨酸，以及第244、252和326位的賴氨酸，才直接參與FEN1-DNA的相互作用。

圖3

4. L209P FEN1干擾WT FEN1核酸酶活性

由于L209P FEN1具有完整的DNA底物結(jié)合親和力，研究者推測(cè)L209P FEN1的存在可能干擾了WT FEN1的活性。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者將不同數(shù)量的每種蛋白質(zhì)與DNA底物混合，并測(cè)定了它們的FEN(圖4A)、EXO(圖4B)和GEN(圖4C)活性。當(dāng)L209P FEN1與WT FEN1共同孵育時(shí)，WT FEN1的活性被抑制。L209P FEN1對(duì)WT FEN1的抑制作用呈劑量依賴性。這些結(jié)果表明，L209P對(duì)WT FEN1的活性呈顯性抑制。

圖4

5. L209P FEN1突變干擾BER效率

剝離結(jié)構(gòu)的去除是完成LP-BER的關(guān)鍵步驟。L209P FEN1活性降低提示該突變可能影響了LP-BER功能。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者使用純化的蛋白進(jìn)行了LP-BER分析。結(jié)果顯示在存在WT FEN1而不是L209P FEN1突變體的情況下，THF的損傷得到了有效的修復(fù)(圖5A)。為了驗(yàn)證L209P FEN1是否干擾WT FEN1的整體BER效率，研究者將純化的L209P FEN1與WT FEN1蛋白混合進(jìn)行LP-BER分析。結(jié)果表明，在L209P FEN1蛋白存在的情況下，BER效率降低(圖5B)。此外，研究者使用SW480細(xì)胞提取物（含或不含其他L209P FEN1蛋白）進(jìn)行LP-BER，以確定L209P FEN1是否會(huì)在細(xì)胞提取物環(huán)境中損害BER。結(jié)果顯示，雖然SW480細(xì)胞提取物可以有效修復(fù)THF損傷，但在細(xì)胞提取物中加入L209P FEN1會(huì)降BER率效率(圖5C)。為了模擬在人結(jié)腸癌細(xì)胞中檢測(cè)到的FEN1雜合L209P體細(xì)胞突變，研究者在也含有內(nèi)源性WT FEN1的SW480細(xì)胞中過(guò)表達(dá)L209P FEN1或WT FEN1，結(jié)果表明，表達(dá)L209P FEN1的細(xì)胞提取物的BER遠(yuǎn)低于表達(dá)WT FEN1的細(xì)胞提取物(圖5D)。上述數(shù)據(jù)表明，在SW480細(xì)胞中純化或表達(dá)的L209P FEN1干擾WT FEN1的BER活性。

圖5

6. L209P FEN1的表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DNA損傷的敏感性

為了研究L209P FEN1變異體在細(xì)胞中可能的生物學(xué)功能，研究者用含L209P或WT FEN1基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染SW480結(jié)腸癌細(xì)胞。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染L209P FEN1的細(xì)胞比轉(zhuǎn)染W(wǎng)T FEN1或轉(zhuǎn)染親本對(duì)照SW480的細(xì)胞對(duì)5-FU或H2O2更敏感，表明含L209P FEN1的細(xì)胞LP-BER修復(fù)存在缺陷(圖6A和B)。熒光激活細(xì)胞分選分析比較5-FU和H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，經(jīng)5-FU或H2O2處理后，表達(dá)FEN1的細(xì)胞的凋亡率明顯高于表達(dá)WT FEN1或親本SW480的細(xì)胞(圖6C)。用細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Caspase-3的抗體進(jìn)行細(xì)胞染色，也證實(shí)了熒光激活的細(xì)胞分選結(jié)果(圖6D和E)。這些數(shù)據(jù)支持了以前的報(bào)道，即DNA損傷如果不修復(fù)，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。然而，由于DNA損傷的積累和基因組的不穩(wěn)定，非凋亡處理的細(xì)胞可能更容易轉(zhuǎn)化。

圖6

7. L209P引起內(nèi)源性DNA損傷和染色體畸變

除了外源性物質(zhì)的損傷外，DNA損傷也可能是代謝或水解過(guò)程的自然反應(yīng)。因此，研究者預(yù)計(jì)L209P細(xì)胞比WT細(xì)胞表現(xiàn)出更高的內(nèi)源性DNA損傷水平。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者檢測(cè)了H2AX組蛋白磷酸化形式(DNAH2AX)的水平，該蛋白是細(xì)胞對(duì)γ斷裂反應(yīng)的早期標(biāo)志物。在沒(méi)有外源性γ損傷的情況下，L209P細(xì)胞磷酸化DNAH2AX的基礎(chǔ)水平高于WT細(xì)胞(圖7A)。此外，在γH2AX抗體染色的細(xì)胞中可檢測(cè)到DSB的核病灶。結(jié)果顯示，含L209P FEN1細(xì)胞的γH2AX陽(yáng)性核數(shù)量多于WT細(xì)胞(圖7B)。結(jié)果表明，L209P FEN1的表達(dá)導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂的積累。接下來(lái)，為了弄清染色體不穩(wěn)定是由于DNA單鏈斷裂(SSB)在S期轉(zhuǎn)化為DNADSB，還是由其他復(fù)制缺陷引起的，研究者將細(xì)胞與抗53BP1(腫瘤抑制因子p53結(jié)合蛋白1)和CENPF(著絲粒蛋白F)的抗體共染色。53BP1是DSB修復(fù)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，53BP1病灶的形成提示DNA復(fù)制效率低下/有缺陷。結(jié)果顯示，在沒(méi)有外源性DNA損傷來(lái)源的情況下，G2中53BP1焦點(diǎn)顯著增加(圖7C)，表明自發(fā)損傷是由未修復(fù)的SSB碰撞引起的。然而在G1(CENPF陰性細(xì)胞)中也觀察到53BP1病灶的增加(圖7D)，表明L209P FEN1也會(huì)導(dǎo)致DNA復(fù)制缺陷。

圖7

為了檢測(cè)Lp-BER在體內(nèi)表達(dá)L209P的細(xì)胞中是否受到抑制，研究者進(jìn)行了堿性彗星試驗(yàn)，評(píng)估了彗星事件在確定的DNA碎裂階段的總體分布(圖7E)。這些階段包括沒(méi)有DNA斷裂的細(xì)胞(階段I)到DNA嚴(yán)重?cái)嗔训募?xì)胞(階段V)。不經(jīng)H2O2處理的SW480細(xì)胞顯示，表達(dá)L209P FEN1的SW480細(xì)胞的自發(fā)DNA鏈斷裂水平相對(duì)高于WT細(xì)胞(階段III和IV，圖7F)。H2O2處理后，所有細(xì)胞系均顯示出嚴(yán)重的DNA損傷(圖7F)。而表達(dá)L209P FEN1的細(xì)胞顯示出比表達(dá)WT FEN1的細(xì)胞更強(qiáng)的DNA損傷。對(duì)彗星階段分布的研究證實(shí)，L209P FEN1突變導(dǎo)致了LP-BER的缺陷，以及Okazaki片段的成熟。

BER缺陷會(huì)導(dǎo)致BER中間體的顯著積累(圖7A-D)，這將導(dǎo)致染色體畸變。為了測(cè)試表達(dá)L209P FEN1的細(xì)胞是否比表達(dá)WT FEN1的細(xì)胞和親本SW480對(duì)照細(xì)胞積累了更多的染色體斷裂，研究者分析了中期細(xì)胞核的染色體畸變，結(jié)果顯示與表達(dá)WT FEN1的親本細(xì)胞和對(duì)照親本細(xì)胞相比，表達(dá)L209P FEN1的細(xì)胞染色體片段和斷裂水平顯著增加(圖8A)。這一結(jié)果表明L209P FEN1的表達(dá)確實(shí)導(dǎo)致了細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定。

8. L209P誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

有報(bào)道稱非整倍體是癌細(xì)胞的標(biāo)志，因此研究者首先測(cè)定了表達(dá)FEN1的WT細(xì)胞和突變型L209P FEN1細(xì)胞的非整倍體率。結(jié)果顯示表達(dá)L209P FEN1的細(xì)胞的非整倍體率幾乎是表達(dá)WT FEN1的細(xì)胞的4倍(圖8B)。這表明，表達(dá)L209P FEN1的細(xì)胞自發(fā)積累染色體片段，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定和非整倍體的出現(xiàn)。這些細(xì)胞異常可能促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并導(dǎo)致克隆性擴(kuò)張。為了確定L209P突變是否促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，研究者進(jìn)行了病灶形成和軟瓊脂錨定非依賴性生長(zhǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明L209P FEN1細(xì)胞比WT FEN1細(xì)胞含有更多的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。研究者進(jìn)一步將表達(dá)L209P FEN1的細(xì)胞、表達(dá)WT FEN1的細(xì)胞和雙親對(duì)照的SW480細(xì)胞注射到成年免疫缺陷小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示表達(dá)L209P FEN1的腫瘤的生長(zhǎng)速率顯著高于WT FEN1和親代對(duì)照組的生長(zhǎng)速率(圖8C)。腫瘤稱重顯示，表達(dá)L209P FEN1的細(xì)胞的平均腫瘤重量顯著高于表達(dá)WT FEN1的細(xì)胞和親本對(duì)照細(xì)胞的腫瘤重量(圖8D)。這些數(shù)據(jù)表明，攜帶L209P FEN1突變的細(xì)胞比WT細(xì)胞更具致瘤性。

 圖8