中文標題：捕獲新轉錄RNA的相互作用體，或促進對不同細胞和系統中總RNA結合蛋白質組的深入研究
發表期刊：Nature Methods
影響因子：28.467
合作單位：中國科學院廣州生物醫學與健康研究所
運用技術：LC-MS/MS蛋白質譜鑒定（由輝駿生物提供技術支持）
● 研究背景
目前系統研究RNA結合蛋白質組的方法主要是基于捕獲多聚腺苷酸(PolyA)RNA，主要是帶有寡聚(DT)包被珠的mRNA。然而PolyA尾巴只在新轉錄的RNA成熟的過程中被添加到RNA中，而一些成熟的mRNA要么是非PolyA的，要么是雙態的。此外，成熟的非PolyA
RNA物種占所有轉錄序列的很大一部分。捕獲與所有類型RNA相互作用的RNA結合蛋白的方法不僅可以擴大我們目前對RNA相互作用組的看法，而且有助于理解非Polya
RNA在生理和疾病中的功能。
● 研究結果
1. 利用RICK技術捕獲新轉錄的RNA互作組
研究者用Eu標記HeLa細胞中的RNA，固定細胞后通過點擊反應使Eu生物素化，然后用鏈霉親和素包裹的珠子提取RNA-蛋白質復合物。凝膠電泳和銀染證實Rick方法成功分離出與EU標記RNA直接相互作用的蛋白質。Western
blotting驗證了Rick對已知RNA相關蛋白的捕獲。
圖1
2. Rick捕獲的RNA種類
研究者對Rick
pull
down樣本進行了RNA測序(RNA-seq)，分析結果(圖2A)與Castello的oligo(DT)捕獲數據相比顯示出明顯的差異，在該數據中，捕獲的RNA中80%是mRNA。接下來，研究者研究了Rick樣本中的富集與三種相關的非PolyA
RNA：CircRNA、近端啟動子RNA(ppRNA)和增強子RNA(ERNA)的oligo(Dt)捕獲情況。在對ppRNA的評估中，與oligo(Dt)捕獲相比，Rick樣本中轉錄暫停基因(TR>4)在TSS周圍積累了更高的RNA-seq信號，這表明僅通過Rick就能有效地分離ppRNA；而非暫停基因(TR<4)差異則很小(圖2B，C)。此外，在Rick樣本中，RNA-seq信號在假定的增強子區域16(6.05%)上有很強的富集，而在寡核苷酸(DT)捕獲中幾乎沒有(0.11%)(圖2D)。RT-qPCR進一步證實，與oligo(Dt)捕獲相比，用Rick提取的非Polya
RNA分離效果良好。簡言之，除Polya
RNA外，Rick還成功地分離出了其他各種RNA種類，表明它也可以富集不是通過寡核苷酸(DT)捕獲方法分離的相關結合蛋白。
圖2
3. RICK法分離蛋白質的特性研究
采用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)對Rick分離的蛋白質進行分析。與oligo(DT)捕獲在不同條件下的比較表明，Rick分離了許多在oligo(DT)捕獲研究中沒有鑒定到的蛋白質）（圖3B），這些差異既不是由于細胞培養、蛋白質組學程序的差異，也不是由Eu標記引起的（圖3A）。
圖3
4. RICK分離蛋白的功能分析
對295個RICK特有的RBP進行了GO分析，觀察了與有絲分裂相關的生物過程的富集(圖4A)。KEGG途徑分析還將“細胞周期”列為前十個最顯著富集的途徑（圖4B）。相反，對Rick鑒定的425種蛋白質進行的GO和KEGG分析顯示，oligo（dT）捕獲數據集中存在的蛋白質主要與RNA相關。綜上所述，這些數據進一步加強了Rick在分離用寡核苷酸(DT)捕獲方法未鑒定出的蛋白質方面的獨特性，并揭示了RNA在意想不到的細胞過程中的功能。
圖4
5. RICK識別與非polyA RNA優先結合的蛋白質
考慮到通過Rick和oligo(DT)捕獲分離的RNA種類的顯著差異，295個RICK特有的RBP中有相當一部分可能優先與非polyA
RNA結合。這種特異性可能是由于化學計量學、亞細胞定位或潛在的內在結合特異性。LC-MS/MS鑒定出914個高置信度蛋白質，稱之為“PolyA缺失型Rick蛋白”。在這914個蛋白質中，576個與標準Rick程序的720個高置信度蛋白質重疊(圖5A)。進一步分析表明，295個RICK特有的RBP中有204個(69.2%)與914個PolyA缺失型Rick蛋白重疊(圖5B)。此外，在710個與RICK特有RBP不重疊的710個polyA缺失型RICK蛋白中，有563個出現在oligo(DT)捕獲數據集中(圖5B)，這表明這些蛋白具有結合PolyA和非PolyA
RNA的混合趨勢。這些結果表明，Rick可用于鑒定優先與非Polya RNA結合的蛋白質。
圖5
6. 與METTL1和CDK1相互作用的RNA特性
我們選擇了兩個Rick特有的RBP
METTL1和CDK1，用PAR-CLIP測序方法研究了它們相互作用的RNA。METTL1的兩個獨立PAR-CLIP測序實驗顯示捕獲的RNA存在廣泛重疊，其中很大一部分也被RICK捕獲。進一步分析證實METTL1與tRNA顯著結合，還與多種推測為非polyA的RNA結合，如內含子RNA和從基因間區域轉錄的RNA（圖5C）。接下來，研究者使用隨機六聚體或寡聚體（dT）引物進行RNA免疫沉淀（RIP），然后進行RT-qPCR，以識別METTL1靶RNA是否具有polyA尾巴。RIP-qPCR顯示，使用隨機六聚體富集了7個mRNA，而使用寡聚(DT)引物只能擴增出其中的3個，證實了METTL1與含有mRNA序列的非PolyA
RNA結合(圖5D)。CDK1
PAR-CLIP測序分析顯示與轉錄自基因間區域和內含子RNA的RNA結合，與RICK捕獲的RNA也存在廣泛重疊。后續分析進一步表明，METTL1和CDK1廣泛地與非PolyA
RNA結合，暗示這兩種蛋白的RNA相關功能被忽視。
7. 利用RICK捕獲新生RNA互作組
研究者對HeLa細胞進行了短Eu標記(0.5、1和2小時)，以研究Rick是否可以捕獲與新生RNA互作的蛋白。鑒定了208種不同的高置信度蛋白質(分別為149、119和143，作用時間分別為0.5、1和2小時)，稱之為“新生富集RBP”和319種低置信度蛋白質(圖6A)。對208個新生富集RBP進行的GO和KEGG通路分析顯示，轉錄和RNA代謝相關術語顯著豐富(圖6B)。進一步的研究表明，新生RNA轉錄和局部代謝物產生之間存在聯系，從而調節表觀基因和潛在的表觀轉錄基因。
圖6
8. 利用RICK獲取mESC總RNA互作組
為證明Rick可以應用于其他類型的細胞，研究者用鏈霉親和素結合辣根過氧化物酶證實了Eu在mESC中的有效摻入，并進行了LC-MS/MS，鑒定出518個高置信蛋白和304個低置信蛋白。這518個高置信度蛋白質中有160個與Kwon等人報告的“mESC
mRNA相互作用組”重疊，而358個是RICK獨有的，因此將其稱為RICK獨有的mESC
RBP。對這358個候選限制性商業慣例的GO分析顯示，RNA結合或PolyA
RNA結合術語豐富。在這358個蛋白中，有95個在mESC中的表達水平高于分化后的細胞，這表明mESC在自我更新或多能性方面具有潛在的作用。因此，Rick可以應用于HeLa以外的不同細胞類型；此外還需要進一步的研究來確定新發現的候選RBP在mESC自我更新/多能性中的作用。
實驗熱線：4006991663
