TMT（Tandem Mass Tags）是由美國Thermo公司研發(fā)的體外同重同位素標(biāo)記的定量技術(shù)。該技術(shù)采用10-plex或16-plex標(biāo)記試劑，可以同時比較10組或16組樣本之間的蛋白表達(dá)差異。TMT同位素試劑標(biāo)記多肽氨基基團(tuán)后，等量混勻多肽并進(jìn)行LC-MS/MS分析。一級質(zhì)譜中，不同樣品來源的同一肽段表現(xiàn)出相同的m/Z；二級質(zhì)譜中，化學(xué)鍵斷裂釋放出報(bào)告離子，低質(zhì)量區(qū)的報(bào)告離子強(qiáng)度反映了該肽段在不同樣品中的相對表達(dá)量，高質(zhì)量區(qū)的肽段碎片離子m/Z反映了該肽段的序列信息。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索，即可得到樣本中所含蛋白及其表達(dá)差異。

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)：疾病標(biāo)志物，發(fā)病機(jī)制，疾病分型等；

生物醫(yī)藥：藥物機(jī)理，藥效評價(jià)，藥物開發(fā)等；

農(nóng)林畜漁：抗逆脅迫，生長發(fā)育，耐藥，致病機(jī)理等。

聯(lián)系技術(shù)支持

18927549347

聯(lián)系技術(shù)支持

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1. Li K. et al: Tyrosine kinase Fyn promotes osteoarthritis by activating the β-catenin pathway. Ann Rheum Dis, 0:1–9 (2018，IF=14.299).

2. Global iTRAQ-based proteomic profiling of Toxoplasma gondii oocysts during sporulation. J Proteomics.(2016 , IF=5.168).

4. Zeng L. et al: Asparagine Synthetase and Filamin A Have Different Roles in Ovarian Cancer. Front Oncol. (2019，IF=4.848).

蛋白組/代謝組實(shí)驗(yàn)

? iTRAQ 定量蛋白質(zhì)組學(xué)

? Label Free 實(shí)驗(yàn)檢測服務(wù)

? LC-MS/MS 蛋白質(zhì)譜鑒定

? DIA 全息掃描定量蛋白質(zhì)
? 廣泛靶向代謝組學(xué)

蛋白/核酸相互作用實(shí)驗(yàn)

? GST pull down

? RNA pull down

? DNA pull down

? Co-IP 免疫共沉淀

? TAP-MS串聯(lián)親和純化

分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

? 基因調(diào)取/合成 (cDNA克隆)

? 熒光定量PCR (qPCR)

? 載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)服務(wù)

? miRNA靶基因驗(yàn)證
? 慢病毒包裝

科研產(chǎn)品

? 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體

? 人cDNA克隆庫

? 慢病毒表達(dá)載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務(wù)

? 單克隆抗體測序

? 抗體從頭測序

? 抗體表達(dá)服務(wù)

? 重組抗體表達(dá)

實(shí)驗(yàn)試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

? Flag 試劑盒

輝駿實(shí)力

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中文標(biāo)題：酪氨酸激酶Fyn通過激活β-連環(huán)蛋白途徑促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎

發(fā)表期刊：Ann Rheum dis

影響因子：14.299

發(fā)表時間：2018年

合作單位：南方醫(yī)科大學(xué)

運(yùn)用技術(shù)：TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析（由輝駿生物提供技術(shù)支持）

● 研究背景

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種年齡相關(guān)性或創(chuàng)傷后退行性關(guān)節(jié)疾病，其確切的發(fā)病機(jī)制仍不明確。目前OA尚無有效的疾病修飾治療方法，迫切需要開發(fā)新的治療藥物。因此，了解控制軟骨細(xì)胞肥大和調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)制對于開發(fā)有效的OA治療方法具有重要意義。

● 研究路線

● 研究結(jié)果

1. Fyn在老年小鼠、創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎小鼠和人類骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨中聚集

研究者首先選取年輕(2個月)和老年(12個月)小鼠的關(guān)節(jié)軟骨來識別與軟骨退化有關(guān)的蛋白質(zhì)。其中酪氨酸激酶Fyn是老年軟骨中表達(dá)最強(qiáng)的蛋白(圖1A)。對4、13和24月齡小鼠的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行Western blotting分析，證實(shí)了老化軟骨中Fyn的顯著增加(圖1B)，F(xiàn)yn的積累伴隨著老年小鼠軟骨的退化和OARSI分級的增加(圖1C，D)。為了確定Fyn在人OA關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)是否升高，研究者比較了接受過全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的老年OA患者（年齡67.00±3.03歲)軟骨和無關(guān)節(jié)炎病史的年輕交通事故患者(30.25±8.18歲)的正常軟骨中Fyn的表達(dá)。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，老年組和OA組軟骨細(xì)胞中Fyn水平明顯升高，同時OA組軟骨結(jié)構(gòu)發(fā)生變性和丟失(圖1E，F(xiàn))。這些結(jié)果表明，Src激酶家族成員Fyn在老年小鼠和OA患者的退變和損傷的關(guān)節(jié)軟骨中聚集。

圖1

2. Fyn基因缺失阻止小鼠創(chuàng)傷后和衰老相關(guān)OA的發(fā)生 

為了確定Fyn在退變或受損軟骨的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中積聚的意義，研究者進(jìn)行了Fyn基因敲除實(shí)驗(yàn)。Western blotting分析顯示了8周齡小鼠軟骨中Fyn基因的缺失(圖2A，B)。與對照組相比，基因敲除組（Fyn-KO小鼠）關(guān)節(jié)軟骨或生長板的形態(tài)和組織均沒有明顯差異，這表明Fyn基因的缺失沒有引起小鼠骨骼發(fā)育異常。與對照組相比，F(xiàn)yn-KO組小鼠的軟骨中的蛋白質(zhì)含量顯著減少，TUNEL染色顯示Fyn-KO小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡明顯減少(圖2G)，軟骨降解程度有所降低。這些結(jié)果表明，F(xiàn)yn的缺失有效地阻止了小鼠創(chuàng)傷后和年齡依賴性O(shè)A的發(fā)展。

圖2

3. Fyn與軟骨細(xì)胞中的β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩(wěn)定

為了探討Fyn促進(jìn)OA發(fā)生的機(jī)制，研究者通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對軟骨前體細(xì)胞系A(chǔ)TDC5中與Fyn相互作用的蛋白進(jìn)行了鑒定，在純化的復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)β-catenin可能是FYN的潛在互作伙伴(圖3A)。IP分析證實(shí)β-catenin與Fyn在ATDC5細(xì)胞(圖3B)、原代軟骨細(xì)胞和軟骨組織中存在相互作用。β-catenin和Fyn的雙重染色也顯示β-catenin與Fyn在ATDC5細(xì)胞中共定位(圖3C)。為了確定Fyn是否磷酸化軟骨細(xì)胞中的β-catenin，研究者在ATDC5細(xì)胞中進(jìn)行了體外Fyn激酶檢測。結(jié)果顯示，F(xiàn)yn免疫沉淀使β-catenin在體外Tyr142處磷酸化，這種磷酸化被Fyn激酶抑制劑PP1或AZD0530抑制（圖3D）。此外，β-catenin及其磷酸化(Tyr142)的表達(dá)通過Fyn SiRNA被顯著下調(diào)(圖3E)，但在ATDC5細(xì)胞中通過Fyn編碼質(zhì)粒的Fyn過表達(dá)而增強(qiáng)(圖3F)。為了驗(yàn)證Fyn在β-catenin信號通路中的關(guān)鍵作用，研究者在ATDC5細(xì)胞中檢測了鈣粘附素-catenin復(fù)合體的形成。PP1對Fyn的抑制或siRNA下調(diào)Fyn的表達(dá)可以穩(wěn)定鈣粘連蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合體，而Fyn的過度表達(dá)則破壞了該復(fù)合體(圖3H)。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)yn與β-catenin相互作用、磷酸化(Tyr142)并使其穩(wěn)定，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞中鈣粘連蛋白-catenin復(fù)合體的解離。

圖3

4. Fyn激活β-catenin途徑促進(jìn)OA的發(fā)生

在Fyn和β-catenin的雙重染色中發(fā)現(xiàn)，隨著Fyn水平的增加，β-catenin從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞核(圖4A)。用促炎因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)處理ATDC5細(xì)胞，誘導(dǎo)Fyn和β-catenin在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的積聚(圖4B)，并增加Fyn的表達(dá)和磷酸化水平(Tyr416)，β-catenin的表達(dá)和磷酸化水平(Tyr142)，以及MMP13的表達(dá)(圖4C)。接下來，研究者評估了老年小鼠和創(chuàng)傷后OA小鼠軟骨中β-catenin及其磷酸化的水平。結(jié)果顯示，β-catenin及其磷酸化水平隨著年齡的增長和OA的加重而增加(圖4D)。此外，創(chuàng)傷后FYN-KO小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的β-catenin水平及其核定位明顯低于對照組(圖4F)。WNT3a是典型的Wnt/β-catenin途徑的激活劑。Fyn的敲除實(shí)驗(yàn)顯示，在OA的發(fā)生發(fā)展過程中，F(xiàn)yn激活了不依賴Wnt信號的β-catenin通路，并增強(qiáng)了β-catenin在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)位。關(guān)節(jié)注射icg-001明顯減少了軟骨損傷，維持了關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖的含量，并降低了OA發(fā)生過程中的關(guān)節(jié)炎分級，退變軟骨中MMP13和ADAMTS5的表達(dá)水平也相應(yīng)降低。這些結(jié)果表明，β-catenin通路參與了Fyn刺激軟骨細(xì)胞MMP13和ADAMTS5的表達(dá)以及小鼠OA的發(fā)生與發(fā)展。

圖4

5. FYN抑制劑AZD0530和PP1抑制β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并阻止小鼠骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生

為了研究Fyn作為OA治療靶點(diǎn)的潛在用途，研究者檢測了Fyn的化學(xué)抑制劑在OA的發(fā)病和進(jìn)展中的作用。AZD0530和PP1是Src激酶(包括Fyn)的選擇性抑制劑，可用于癌癥的治療。注射小鼠后，與賦形劑治療的小鼠相比，AZD0530和PP1治療顯著減少了軟骨的破壞(圖5A)、OARSI分級(圖5B)和滑膜炎癥，MMP13、ADAMTS5和X膠原含量、TUNEL陽性軟骨細(xì)胞數(shù)和骨鈣素表達(dá)也顯著減少(圖5C，D)。這些結(jié)果表明，抑制Fyn激酶活性可以阻止小鼠創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。Western blotting顯示AZD0530或PP1可阻斷IL-1β刺激引起的MMP13和ADAMTS5的上調(diào)，并抑制p-β-catenin(Tyr142)的增加（圖5E）。接下來，研究者檢測了用或不用AZD0530或PP1AZD0530或PP1治療的創(chuàng)傷后OA小鼠的軟骨樣本中p-β-catenin(Tyr142)的表達(dá)。結(jié)果顯示，AZD0530和PP1處理的小鼠，MMP13、p-FYN和p-β-catenin(Tyr142)的表達(dá)均明顯降低(圖5F)。此外，用AZD0530或PP1治療OA時，F(xiàn)yn和β-catenin在軟骨細(xì)胞核中的共存也被取消(圖5G)。這些結(jié)果表明，AZD0530和PP1通過抑制FYN誘導(dǎo)的磷酸化β-catenin的表達(dá)來預(yù)防OA的發(fā)生。

圖5