SILAC-IP * 實驗原理

用SILAC結(jié)合免疫共沉淀（CoIP）尋找相互作用蛋白是SILAC在定量蛋白質(zhì)組學研究基礎(chǔ)上的進一步應(yīng)用，稱之為SILAC-IP技術(shù)。該技術(shù)通過質(zhì)譜鑒定和分析蛋白質(zhì)相對量來判斷是否是特異性結(jié)合誘餌蛋白，當實驗組與對照組中某個蛋白質(zhì)量含量達到統(tǒng)計學的差異時，就判定這個蛋白質(zhì)與誘餌蛋白質(zhì)具有相互作用。SILAC技術(shù)是先將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素，即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復合物分離后，混在同一管中做酶切質(zhì)譜等。這樣既能鑒定到復合物蛋白，又能根據(jù)同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量，從而更準確地判斷出互作蛋白。

SILAC-IP * 實驗方案

不同的實驗背景和目的需對應(yīng)用不同方案，輝駿生物提供以下三種SILAC-IP實驗方案：

方案一：以野生型細胞株為實驗材料

1．分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)細胞，取等量標記好的細胞提取蛋白質(zhì)；
2．提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白分別用Normal IgG和抗bait蛋白的特異抗體做Co-IP；
3．混合輕、重鏈Co-IP產(chǎn)物；
4．胰酶酶切，LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

方案二：以過表達誘餌蛋白的細胞株為實驗材料

1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)正常對照細胞和過表達誘餌蛋白的細胞株(帶標簽)，取等量標記好的細胞分別提取蛋白質(zhì)，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體做Co-IP；
3. 收集Co-IP后的蛋白液，胰酶酶切，LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

方案三：以干擾誘餌蛋白的細胞株為實驗材料

1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養(yǎng)RNAi 誘餌蛋白的細胞株和正常對照細胞株，取等量標記好的細胞分別提取蛋白質(zhì)，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體做Co-IP；
3. 收集Co-IP后的蛋白液，胰酶酶切，LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

SILAC-IP * 應(yīng)用背景

免疫共沉淀（Co-IP）在分離純化蛋白復合物過程中，不可避免地會出現(xiàn)非特異結(jié)合蛋白，這些蛋白會一并被質(zhì)譜鑒定出來，成為假陽性的互作蛋白，影響后續(xù)挑選驗證。 傳統(tǒng)的判斷假陽性互作蛋白方法是：用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表，扣除掉對照組鑒定到的蛋白列表，作為“互作蛋白”。但很多真實的互作蛋白，比如豐度比較高的蛋白，在對照組中也會出現(xiàn)，而傳統(tǒng)的方法就會被排除掉。SILAC-IP技術(shù)將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素，結(jié)合質(zhì)譜分析，既能鑒定到復合物蛋白，又能根據(jù)同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量，從而更準確地判斷出互作蛋白。

相較于傳統(tǒng)的免疫共沉淀和pull down技術(shù)，SILAC-IP技術(shù)特異性強，假陽性極低，通量高，靈敏度高，能直接檢測出與bait蛋白互作的其他蛋白的相對含量；適合于可傳代細胞，尤其是易轉(zhuǎn)基因細胞。

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SILAC-IP * 輝駿服務(wù)內(nèi)容

SILAC-IP（SILAC標記的免疫共沉淀）檢測服務(wù)
服務(wù)項目	服務(wù)內(nèi)容	結(jié)果交付	實驗周期	客戶提供	價格
SILAC-IP	Co-IP預實驗	input和CoIP產(chǎn)物的Western blot檢測圖	2-3周	未標記的待測細胞 SILAC標記完全的待測細胞 誘餌蛋白的IP級抗體 實驗信息表（樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列）	點擊詢價
	SILAC標記效率檢測	標記效率檢測表 標記效率檢測報告	2-3周
	Western blot檢測SILAC標記細胞（input）中的誘餌蛋白	Western blot檢測圖	7-8周
	CoIP實驗調(diào)取誘餌蛋白及其互作蛋白	Western blot檢測圖 CoIP實驗報告
	IP產(chǎn)物的SILAC蛋白定量檢測和分析	質(zhì)譜檢索表 互作蛋白篩選表 互作蛋白生物信息學分析結(jié)果 SILAC檢測和分析報告

SILAC-IP * 結(jié)果示例

silac ip：質(zhì)譜檢索表格（部分展示）

SILAC-IP  * 客戶文獻

1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017，IF=2.629. 【研究內(nèi)容】：為了更好地研究CREB/ATF家族成員SCIRR69在ER應(yīng)激過程中的功能作用，研究者首先用ER應(yīng)激激活劑(TG)和衣霉素(TM)處理了SCN和PC12細胞,，qRT-PCR和western結(jié)果顯示SCIRR69可能在ER應(yīng)激中起重要作用。采用SILAC IP方法篩選出ER過程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1，并通過Co-IP技術(shù)驗證了它們與SCIRR69的相互作用。研究結(jié)果有助于更好地理解SCIRR69在ER應(yīng)激中的基本功能。 使用相關(guān)技術(shù)：silac ip檢測、silac ip服務(wù)、SILAC IP免疫共沉淀實驗服務(wù)

2. Edward. E. et al Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. Journal of Visualized Experiments.  2014，IF=1.163. 【研究內(nèi)容】：每個骨髓瘤患者都有多個亞克隆，具有高或低染色體不穩(wěn)定性(CIN)特征的多個亞克隆共存會導致異質(zhì)性和耐藥性，導致疾病復發(fā)。作者通過串聯(lián)親和純化質(zhì)譜(TAP-MS)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了CIN基因NEK2與脫泛素酶USP7結(jié)合。該結(jié)合阻止了NEK2泛素化并使其穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，使用NEK2或USP7抑制劑進行靶向治療可能是骨髓瘤最有效的輔助治療方法。 使用相關(guān)技術(shù)：silac ip技術(shù)、silac ip免疫共沉淀、SILAC-IP質(zhì)譜

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? Co-IP 免疫共沉淀

? TAP-MS串聯(lián)親和純化

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?熒光定量PCR (qPCR)

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? 慢病毒表達載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務(wù)

? 單克隆抗體測序

? 抗體從頭測序

? 抗體表達服務(wù)

? 重組抗體表達

實驗試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

? Flag 試劑盒

輝駿實力

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SILAC-IP（SILAC標記的免疫共沉淀）服務(wù)介紹

SILAC-IP是在SILAC標記細胞中進行Co-IP（免疫共沉淀）的技術(shù)。

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SILAC IP實驗服務(wù)*輝駿優(yōu)勢

SILAC標記的免疫共沉淀實驗樣本要求

1. 送樣要求

2. 樣本保存和運輸要求：

（1）活細胞常溫取樣；

（2）凍存細胞干冰取樣/運輸：需要至少在送樣前一天通知我方。

silac-ip技術(shù)服務(wù)結(jié)果示例

silac ip：質(zhì)譜檢索表格（部分展示）

免疫共沉淀SILAC-IP 客戶文獻

1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017，IF=2.629. 【研究內(nèi)容】：為了更好地研究CREB/ATF家族成員SCIRR69在ER應(yīng)激過程中的功能作用，研究者首先用ER應(yīng)激激活劑(TG)和衣霉素(TM)處理了SCN和PC12細胞,，qRT-PCR和western結(jié)果顯示SCIRR69可能在ER應(yīng)激中起重要作用。采用SILAC IP方法篩選出ER過程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1，并通過Co-IP技術(shù)驗證了它們與SCIRR69的相互作用。研究結(jié)果有助于更好地理解SCIRR69在ER應(yīng)激中的基本功能。 使用相關(guān)技術(shù)：silac ip檢測、silac ip服務(wù)、SILAC IP免疫共沉淀實驗服務(wù)

2. Edward. E. et al Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. Journal of Visualized Experiments.  2014，IF=1.163. 【研究內(nèi)容】：每個骨髓瘤患者都有多個亞克隆，具有高或低染色體不穩(wěn)定性(CIN)特征的多個亞克隆共存會導致異質(zhì)性和耐藥性，導致疾病復發(fā)。作者通過串聯(lián)親和純化質(zhì)譜(TAP-MS)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了CIN基因NEK2與脫泛素酶USP7結(jié)合。該結(jié)合阻止了NEK2泛素化并使其穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，使用NEK2或USP7抑制劑進行靶向治療可能是骨髓瘤最有效的輔助治療方法。 使用相關(guān)技術(shù)：silac ip技術(shù)、silac ip免疫共沉淀、SILAC-IP質(zhì)譜

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